生长因子是指在细胞间传递信息并对细胞生长具有调节功能的一些多肽类物质，它与种子细胞、支架材料共同组成生物组织工程的核心及三要素，它对细胞增殖、组织或器官的修复和再生都具有重要的促进作用。组织工程研究中生长因子的种类繁多，新的生长因子亦在不断的被发现。生长因子对组织调节作用的研究，从以前的单一生长因子模式开始向多生长因子间相互作用研究模式转变，不同时间阶段、不同生长因子的表达与作用均不相同，因此如何适时、适量以及怎样发挥生长因子之间的相互作用来更好的模拟体内微环境，探究生长因子对组织调节作用的分子机制以及发现新的生长因子等都是组织工程中的研究重点。

1.用于软骨或成骨分化的常用生长因子

转化生长因子TGFs、胰岛素样生长因子(IGFs)、骨形态发生蛋白BMP和地塞米松是最广泛用于刺激干细胞软骨或成骨分化的生长因子和激素（见图1）。

图1. 常见的用于组织的各种生长因子[1]

1)转化生长因子TGFs (Transforming growth factors, TGFs)

TGFs是一类可以影响细胞生长、增殖和分化等行为的多肽家族。TGFs有两种类型，分别是TGF-β和TGF-β型，它们具有独特的氨基酸序列，与受体的相互作用也不同。TGF-β家族已被证明能有效诱导干细胞软骨分化。TGF-β1和TGF-β3都被广泛用于软骨和骨软骨组织再生的间充质干细胞（MSCs）的软骨分化和软骨表型维持，并对不同类型的水凝胶和不同来源的MSCs都有良好的作用。然而，它们的影响可能并不完全相同。有报道称[2]，与TGF-β3在MSCs软骨分化中的中度作用相比，TGF-β1导致软骨相关基因表达显著增加。TGF-β1促进细胞粘附分子表达，促进细胞凝结，而TGF-β3促进细胞增殖。此外，TGF-β1和TGF-β3影响骨髓间充质干细胞不同阶段的软骨分化。因此，TGF-β1和TGF-β3联合使用可能更有效地促进间充质干细胞的软骨形成。

2)胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor, IGF)

IGF是一类多功能细胞增殖调控因子，包括IGF-1和IGF-2两种,在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用[3]。IGF-1主要由肝脏在生长激素刺激下分泌，调节成人的生长,IGF-2被认为在胎儿发育中发挥重要作用。由于IGF-1对软骨稳态、蛋白多糖合成平衡和分解有影响，IGF-1具有很强的合成代谢刺激作用，可促进软骨细胞的有丝分裂、Ⅱ型胶原及 软骨蛋白聚糖（Aggrecan）的合成，促进间充质干细胞向软骨分化，有利于软骨发生及软骨细胞沉淀,因此在软骨修复方面得到了广泛的研究。

3)骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)

骨形态发生蛋白家族是TGF-β超家族的亚科，这些因子在调节细胞生长、间充质干细胞分化和组织再生及重塑方面发挥重要作用，能够诱导动物或人体MSCs分化为骨、软骨、韧带、肌腱和神经[4]。到目前为止，大约发现有20个BMP家族成员(BMP-1-18、BMP-3b和BMP-8b)。具体来说，BMP-1、5、9、13和14在软骨形成和间充质干细胞的软骨分化中发挥作用；BMP-3、4和8在骨形成中发挥关键作用;BMP – 2和7可诱导成骨/软骨分化和骨/软骨形成。其中，最广泛用于骨和软骨再生的是BMP-2和7。

4)地塞米松(Dexamethasone, DEX) 

地塞米松是一种肾上腺皮质激素，具有抗炎、抗内毒素、抑制免疫、抗休克及增强应激反应等药理作用。除此之外，在组织工程中，在培养基中加入地塞米松或与水凝胶网络共价结合，地塞米松可以诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。地塞米松常作为TGF或BMP的补充，进一步促进细胞增殖，最大化成软骨或成骨诱导作用，达到最佳的成软骨或成骨效果。

除此之外，研究发现碱性成纤维细胞生长因子、软骨调节素、血管内皮细胞生长因子、 表皮生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生生长因子、 软骨素酶-ABC、维生素C等也具有刺激干细胞成软骨或成骨分化的作用。

2.生长因子的传递方式

一般来说，传递生长因子的方法通常为以下几种（图2）:培养基中的自由传递，水凝胶中的物理封装，与水凝胶的共价结合，微球载体，以及基因传递。

图2.骨和软骨缺损中的生长因子的传递方式[5]

1)培养基中的自由传递

在培养基中自由传递生长因子是一种有效的体外培养满载细胞的水凝胶软骨/骨软骨结构物的方法。然而，频繁的给药是为了维持培养基中生长因子的浓度和生物活性，这对于工程组织构建物的长期培养和成熟不是最佳的。此外，这种给药方式不适用于体内软骨生成和骨生成。

2)水凝胶物理封装

在水凝胶中封装生长因子被证明是一种简单有效的实现持续释放的方法。有研究表明[6]，BMP-2直接加入负载MSCs的壳聚糖-丙交酯-纤维蛋白原水凝胶中，可刺激成骨分化。骨相关生物标志物表达的释放研究和表征显示（图3），BMP-2可以持续释放4周，并通过增加碱性磷酸酶的活性和矿化来诱导成骨分化。通过水凝胶包封的生长因子递送不需要多次剂量，并且可以维持长达数周的释放，这有利于工程软骨/骨软骨结构的长期培养。此外，该方式还适用于体内的软骨生成和成骨。然而，随着时间的推移，水凝胶释放的生长因子的数量会显著减少，这可能会限制成软骨和成骨诱导的效率。

图3.封装BMP-2的水凝胶刺激成骨分化[6]

3)与水凝胶共价结合的方式

除了简单地将生长因子物理包裹在水凝胶中，TGF-β1还可以通过共价键固定到巯基烯聚乙二醇（PEG）水凝胶中，以促进被包裹软骨细胞的增殖和软骨细胞外基质（ECM）的产生[7]。结果表明，TGF-1可均匀分布于PEG水凝胶中，显著提高了软骨细胞的增殖率以及28天内聚集蛋白和II型胶原的产生，其水平超过了在培养基中自由添加TGF-β1的水凝胶中软骨细胞的水平（图4）。这种生长因子传递方法可使用较低的总剂量但仍能促进高水平的细胞增殖和ECM产生，并可用于体内软骨再生。

图4. 共价结合TGF-β1水凝胶组的软骨细胞增殖增加（A）和ECM产生增强（B）[7]

4)微球传递

局部生长因子释放是培养具有受控细胞表型的骨软骨结构的实用策略。为此，可以将成软骨和成骨生长因子加载到微载体中，并嵌入支架的不同区域[8]，可控的局部生长因子释放能分别诱导软骨区和软骨下骨区的间充质干细胞分化成软骨和成骨，从而不需要在培养基中预分化的或者额外的生长因子。在一项研究中[9]，将TGF-β1和BMP-2负载在聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球中，并将这些微球包裹在满载MSCs的水凝胶的分离层中，以分别诱导成软骨和成骨分化。体内实验结果显示（图5），形成了带状的骨软骨组织，TGF-β1的控制释放可以改善软骨的生成，并在12至24周期间保持软骨的完整性。因此，微球包裹生长因子是控制释放速率和提高释放效率的有效策略。

图5.负载含生长因子PLGA微球水凝胶植入12周后的骨软骨组织修复的代表性组织切片[9]

5)基因传递

将治疗性基因植入生物材料是一种较新的促进组织再生的生长因子传递方法。例如，海藻酸盐水凝胶中TGF-β3和BMP-2的基因传递平台已经被开发出来用于软骨和骨软骨组织[10]。结果表明，通过编码纳米羟基磷灰石(nHAp)质粒DNA (pDNA)实现了转基因的持续过表达，TGF-β3和BMP-2的基因传递导致聚集蛋白聚糖和胶原蛋白的产生显著增加（见图6）。与单纯递送TGF-β3或BMP-2相比，编码TGF-β3和BMP-2的基因共递送产生了更多的II型胶原沉积。该平台可用于产生细胞功能梯度和工程组织特性，以再生复杂组织和组织界面，包括软骨和骨软骨组织。

图6.递送平台载体外培养28天后的糖胺聚糖（A、B）和胶原蛋白含量（C、D）[10]

3．小结

受气候变化、冲突、交通等因素的影响，骨软骨缺损损伤呈增加趋势。使用生长因子进行骨和软骨组织再生，在处理骨软骨损伤和缺陷方面具有巨大潜力。根据文献综述[5]，基于生长因子的组织再生的主要因素在于长期维持生长因子的最佳临界治疗浓度，以确保稳健的愈合过程。这种最佳浓度的生长因子，可以通过编程释放曲线（采用各种递送方式）和利用ECM蛋白、生长因子和细胞因子的联合作用来实现。

[1] J. Zhang , E. Wehrle , M .Rubert,. 3D Bioprinting of human tissues: biofabrication, bioinks and bioreactors, Int. J. Mol. Sci. 22 (2021) 3971. 

[2] T. Watabe, K. Miyazono, Roles of TGF-beta family signaling in stem cell

renewal and differentiation, Cell Res. 19 (1) (2009) 103–115.

[3] M.B. Schmidt, E.H. Chen, S.E. Lynch, A review of the effects of insulin-like growth factor and platelet derived growth factor on in vivo cartilage healing and repair, Osteoarthritis Cartilage 14 (5) (2006) 403–412.

[4] P.C. Bessa, M. Casal, R.L. Reis, Bone morphogenetic proteins in tissue

engineering: the road from the laboratory to the clinic, part I (basic

concepts), J. Tissue Eng. Reg. Med. 2 (1) (2008) 1–13.

[5] M. Qasim, D.S. Chae, N.Y. Lee, Bioengineering strategies for bone and cartilage tissue regeneration using growth factors and stem cells, J. Biomed. Mater. Res. 108A (2020) 394–411.

[6] S. Kim, K. Bedigrew, T. Guda, W.J. Maloney, S. Park, J.C. Wenke, Y.P. Yang,Novel  osteoinductive  photo-cross-linkable chitosan-lactide-fibrinogenhydrogels enhance bone regeneration in critical size segmental bonedefects, Acta Biomater. 10 (12) (2014) 5021–5033.

[7] B.V. Sridhar, N.R. Doyle, M.A. Randolph, K.S. Anseth, Covalently tethered TGF-β1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production, J. Biomed. Mater. Res. A 102 (12) (2014) 4464–4472.

[8] R. Reyes, A. Delgado, E. Sanchez, A. Fernandez, A. Hernandez, C. Evora, Repair of an osteochondral defect by sustained delivery of BMP-2 or TGFbeta1 froma bilayered alginate-PLGA scaffold, J. Tissue Eng. Reg. Med. 8 (7) (2014) 521– 533.

[9] S. Lu, J. Lam, J.E. Trachtenberg, E.J. Lee, H. Seyednejad, J.J. van den Beucken, Y. Tabata, M.E. Wong, J.A. Jansen, A.G. Mikos, F.K. Kasper, Dual growth factor delivery from bilayered, biodegradable hydrogel composites for spatially-guided osteochondral tissue repair, Biomaterials 35 (31) (2014) 8829–8839.

[10]T. Gonzalez-Fernandez, E.G. Tierney, G.M. Cunniffe, F.J. O’Brien, D.J. Kelly,Gene delivery of TGF-b3 and BMP2 in an MSC-laden alginate hydrogel for articular cartilage and endochondral bone tissue engineering, Tissue Eng. Part A 22 (9–10) (2016) 776–787.